Pewarnaan Gram Positif dan Negatif

I.              Judul

Pewarnaan Gram Positif dan Gram Negatif

II.           Tujuan

Memahami dan dapat melakukan pewarnaan positif dan negatif pada bakteri

Membedakan dan menentukan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif

Mengamati morfologi bakteri Bacillus substillis dan Escherichia coli

III.        Dasar Teori

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur, dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hamper tidak berwarna dan kontras dengan air. Supaya bakteri dapat dilihat dengan mudah dan dipelajari maka tingkat sel kontras itu dapat ditingkatkan dengan cara pewarnaan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. (Dwijoseputro, 1981). Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung. Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. (Alcamo, I.E, 1996).

Ada beberapa macam pewarnaan, yaitu

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

Pewarnaan Asam

Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.

 Pewarnaan Basa

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. (Tjitrosomo, 1982)

Pewarnaan Diferensial (Gram) adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

 Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku. (Dwidjoseputro.1981). Pengamatan bentuk dan ukuran sel bakteri akan tampak jelas jika dilakukan pewarnaan terhadap sel. Metode pewarnaan sel bakteri ini pertama kali dikembangkan oleh Christian Gram pada tahun 1884 yaitu seorang ahli bakteriologi Denmark. Dia mengembangkan prosedur pewarnaan ini selagi mencari suatu metode untuk memperlihatkan bakteri pneumokokus pada jaringan paru-paru pasien yang mati karena pneumonia. Selain itu dia melihat bahwa beberapa spesies bakteri dapat dibedakan dengan prosedur pewarnaan ini. Berhasil atau tidaknya pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang akan diwarnai (umur biakan paling baik adalah 24jam). (Kawuri, dkk, 2007) Perbedaan tebal tipisnya struktur peptidoglikan menentukan mekanisme yang spesifik terhadap penyerapan zat warna. Sifat ini dipergunakan untuk membantu identifikasi suatu bakteri sehingga dikenal adanya bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bentuk dasar bakteri terdiri atas bentuk bulat (kokus), batang (basil), dan spiral (spirilia) seerta terdapat bentuk antara kokus dan basil yang disebut kokobasil. (Pelczar, dkk, 1986)

IV.        Alat dan Bahan

Alat yang digunakan:

Botol semprot

Jarum Ose

Kaca preparat

Kaca penutup

Mikroskop

Pembakar Bunsen

Bahan yang digunakan:

Akuades

Air kran

Alkohol 70% (desinfektan)

Alkohol 96%

Biakan bakteri Escherichia coli

Biakan bakteri Bacillus substillis

Kristal violet

Lugol

Safranin

V.           Cara Kerja

Kaca objek dan kaca penutup

Dicuci dengan air

                                                            Dibersihkan dengan alcohol

                                                            Dikeringkan

                                                            Diteteskan 1 tetes akuades di bagian tengah

                                                Kaca objek dengan tetesan akuades

Ditambahkan sampel bakteri dengan jarum ose dari biakan murni

                                                            Diratakan dengan jarum ose

                                                            Difiksasi

                                                Bakteri pada kaca objek

                                                            Ditambah violet hingga terendam selama 1 menit

                                                            Dicuci di air mengalir perlahan

                                                            Ditambahkan lugol hingga terendam selama 1 menit

                                                            Dicuci di air mengalir perlahan

Ditetesi pertetes alcohol 96% selama 5 detik

Dicuci di air mengalir perlahan

Diteteskan safranin hingga terendam bakterinya selama 1menit

Dicuci di air mengalir perlahan

Dikeringkan di udara

                                                Bakteri hasil pewarnaan

                                                            Diamati di bawah mikroskop

                                                Morfologi dan cirri-ciri bakteri gram positif dan negatif

                                                           

VI.        Daftar Pustaka

Alcamo, I.E. 1996. Fundamentl of Microbiology, 5^th Edition. Addison Wesly Longman, Inc: New York.

Anggita. 2012. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. UIN SGD: Bandung.

Dwijoseputro. 1981. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan: Surabaya.

Kawuri, R,Y Ramona, dkk. 2007. Buku Ajar Mikrobiologi Farmasi. UNUD: Bukit Jimbaran

Pelczar Jr, dkk. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta.

Tjitrosomo. 1982. Dunia Mikroba. Bharata Karya: Jakarta.

Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri.  http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html

(diunduh 11 November 2012 pukul 20.46 wib)

Eri Tirtayasa. 2011. Perbedaan dasar bakteri gram. http://Eri08tirtayasa.blogspot.com/2011/03/perbedaan-dasar-antara-bakteri-gram.html?m=1 (diunduh tanggal 12 november pukul 19.34 wib)