Pewarnaan gram positif dan negatif part 2
Pada praktikum ini dilakukan
pewarnaan, tujuan dari pewarnaan ini adalah untuk mempermudah pengamatan
bentuksel mikroorganisme (khususnya bakteri), untuk dapat mengamati struktur
luar dan dalam sel mikroba yang dipelajari, untuk memperjelas ukuran
jasad,untuk identifikasi mikroba, misalnya bakteri gram positif, negatif,
bakteri tahan asam, serta untuk dapat melihat reaksi jasad terhadap pewarna
yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia jasad dapat diketahui.
Perbedaan dasar antara bakteri gram
negatif dan gram positif adalah pada dasarnya pada komponen dinding selnya.
Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang
tebal, sedangkan bakteri gram negatif lapisan peptidoglikannya tipis sehingga
dapat menyerap zat pewarna sekunder. Selain itu, adapula perbedaan sifat dari
bakteri gram negatif dan positif, yaitu kandungan lipid pada gram negatif
tinggi sedangkan pada gram positif rendah, gram positif memiliki ketahanan
terhadap penisilin yang lebih sensitive sedangka gram negatif lebih tahan,
kemudian penghambatahan warna basa pada gram positif lebih dihambat sedangkan
pada gram negatif kurang dihambat, kebutuhan nutrient pada gram positif
kompleks sedangkan pada gram negatif relatif sederhana, dan berdasarkan
ketahanan terhadap perlakuan fisik pada gram positif lebih tahan dibandingkan
pada gram negatif.
Pada praktikum
pewarnaan ini digunakan beberapa zat warna, zat warna itu sendiri adalah suatu
senyawa organik yang mengandung gugus benzen, grup khromophor dan auksokhrom.
Khromophor atau radikal warna adalah bahan kimia yang memberikan warna spesifik
pada senyawa yang mengandung grup auksokhrom dalam pembentukkan zat warna,
auksokhrom itu sendiri merupakan grup yang mempunyai kekuatan untuk membentuk
garam dan berfungsi untuk memindahkan warna dari zat warna ke objek, terdiri
dari zat warna basa dan zat warna asam. Pada praktikum ini digunakan violet
(ungu) dan safranin (merah) sebagai zat warna.
Sebelum melakukan prosedur pewarnaan
terhadap bakteri, ada beberapa hal yang perlu diperhatikan, seperti kaca objek dan
kaca penutup dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70% untuk menghilangkan
debu atau lemak yang terdapat pada kaca objek dan kaca penutup yang dapat
mengganggu pengamatan.Kemudian menyemprot meja dan pakaian serta tangan dengan
menggunakan desinfektan atau alcohol 70% supaya tidak ada mikroorganisme atau
pengotor lain yang mengganggu proses pengamatan (tidak terkontaminasi
mikroorganisme luar). Dengan kata lain setiap tahap harus dilakukan secara
aseptis, yaitu terbebas dari bakteri atau mikroorganisme lain.
Praktikum secara aseptis, yaitu
dengan cara elakukan praktikum di dekat api, supaya bakteri atau mikroorganisme
yang berasal dari lingkungan mati dan tidak mengganggu pengamatan ataupun
pproses pewarnaan.
Biakan bakteri yang digunakan
adalah biakan bakteri Eschericia coli dan
Bacillus substillis. Biakan bakteri ini merupakan sumber
mikroorganisme (bakteri) yang diambil sebagai preparat padat dalam bentuk agar
miring. Pengambilan bakteri dari biakan ini menggunakan jarum ose dengan cara
mengambil sesedikit mungkin bakteri dari biakan, bukan mengambil mediumnya yang
berwarna kuning, melainkan mengambil bagian yang warna putihnya (preparat
padat). Ini dilakukan secara aseptis dan hati-hati agar yang terambil adalah
benar-benar bakterinya bukan mediumnya. Kultur bakteri murni ini diambil dan
diratakan setipis mungkin di atas kaca objek yang bersih sampai kira-kira
membentuk lingkaran dengan diameter ±1cm. dalam pengambilan kultur bakteri ini
tidak diambil terlalu banyak karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan
dan apabila kultur bakteri ini tidak diratakan tipis-tipis, maka bakteri akan
tertimbun dan mengakibatkan pengamatan tidak menjadi jelas. Biakan murni
bakteri (preparat padat) dari agar miring:
Biakan
bakteri Eschericia coli
dalam agar
miring
Kemudian pewarnaan diferensial
terlebih dahulu dibuat preparat, dan fiksasi dapat dilakukan dengan melewatkan
preparat ulas diatas nyala api, adapun tujuan dilakukan fiksasi antara lain
untuk melekatkan sel bakteri pada objek glass, mematikan sel bakteri, seperti pada
hasil pengamatan berikut:
Proses fiksasi
Pada pewarnaan ini ditetesi
beberapa tetes violet hingga terendam bakterinya agar terwarnai semua. Larutan
violet merupakan salah satu zat warna yang digunakan dalam proses pewarnaan,
larutan violet ini adalah sebagai zat warna primer atau utama yang akan diikat
oleh peptidoglikan bakteri. Warnanya adalah warna ungu. Pada gram positif akan
tetap dipertahankan sedangkan pada gram negative akan luntur oleh alcohol
akibat ketebalan dindingselnya. Seperti pada pengamatan di bawah ini:
Pewarnaan dengan violet
Setelah proses pewarnaan dilakukan
pemucatan atau pembuangan zat warna yang berlebihan dengan cara dialiri oleh
air kran perlahan-lahan pada bagian sekitar bakteri, tidak boleh terlalu besar
atau kuat alirannya dikhawatirkan bakteri dan zat warna terhapus pada kaca
objek. Dan ditetesi lugol untuk melekatkan zat warna pada bakteri dan membentuk
kompleks lugol-violet.
Pengamatan
dialiri air kran
Setelah pewarnaan dilakukan
pemucatan dengan alkohol 96%, secukupnya beberapa saat (selama ±45 detik)
sampai pewarna utama luntur, fungsinya sebagai bahan peluntur untuk melunturkan
zat warna utama. Sehingga dapat diketahui bila saat pengamatan di bawah
mikroskop bakteri berwarna merah berarti ia gram negatif dan bila tetap ungu
adalah bakteri gram positif.
Pewarnaan dengan safranin sebagai
cat atau zat warna sekunder berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah
kehilangan warna cat utamanya. Zat warna ini memberikan warna merah, seperti
pada hasil pengamatan berikut:
Pewarnaan dengan safranin
Kaca preparat bakteri etelah
pewarnaan dilakukan pengamatan di bawah mikroskop dengan perbesaran 40x100.
Kaca preparat yang telah dialirkan air kran harus kering dengan cara
dikeringkan di udara agar pada saat pengamatan di bawah mikroskop tidak
terganggu oleh kristal air yang ada. Dan kaca preparat berisi bakteri seperti
pengamtan berikut:
Kaca preparat bakteri dan mikroskop
cahaya yang digunakan
Pada praktikum ini didapat bahwa
bakteri Eschericia coli adalah
bakteri gram negative, karena menghasilkan warna merah. Bakteri ini berbentuk
basil (batang) yang pendek, koloninya tersusun seperti rantai memanjang. Warna
merah yang timbul adalah karena bakteri tersebut memiliki lapisan peptidoglikan
yang tipis sehingga bakteri akan menyerap zat warna violet, tetapi ketika
penambahan alkohol 96%, violet pada bakteri gram negative inijadi luntur
disebabkan struktur dinding selnya yang sebagian besar tersusun oleh lipid,
sehingga akan menyerap kembali pewarna safranin dan ikatan antara violet-lugol
dengan lapisan peptidoglikan lebih sedikit terjadi dan bakteri lebih dominan
terwarnai safranin yang berwarna merah.
Hasil
pengamatan Eschericia coli di bawah
mikroskop
Pada pewarnaan bakteri Bacillus substillis, didapat pengamatan
di bawah mikroskop, yaitu berbentuk batang dan merupakan bakteri gram positif,
karena pada tahap dekolorisasi (pewarnaan) warna yang dihasilkan sama dengan
warna utama, yaitu warna ungu. Ini menunjukkan bahwa dinding selnya tebal
sehingga saat bakteri mengalami dehidrasi, pori-porinya menciut yang akhirnya
menyebabkan warna utama tidak bisa keluar, tetap berwarna ungu. Seperti pada
pengamatan di bawah ini:
Hasil
pengamatan Bacillus substillis
di bawah mikroskop
Tercuci tidaknya warna dasar pada
saat pewarnaan bakteri tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen
dinding sel kuat, maka mengikat warna dari bakteri tersebut. Dinding sel pada
bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam
persentasi lebih tinggi dn dinding selnya tipis. Selain itu, pemberian alcohol
pada praktikum pewarnaan bakteri menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel
dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negative dan pada
gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlauan alcohol, pori-pori
mengkerut, daya rembes dinding sel dan membrane menurun sehingga pewarna
safranin tidak dapat masuk dan sel tetap berwarna ungu.
Beberapa hal yang mempengaruhi
hasil pewarnaan gram, antara lain umur bakteri (semakin lama, akan semakin
membelah), fiksasi, bila fiksasi terlalu lama, dinding sel akan pecah dan gram
positif akan melepaskan warna primer atau warna ke-1, kemudian lamanya
pewarnaan (pengeringan setelah diwarnai), dan penambahan alkohol, harus
menggunakan pemucat yang relevan, apabila berlebihan, maka akan mengganggu
pengamatan.
Peran bakteri Eschericia coli adalah bahwa bakteri ini
hidup dalam jumlah besar dalam usus manusia dan hewan untuk membantu sistem
pencernaan, bakteri ini dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada
level pencemaran air, serta mendeteksi pathogen pada feses manusia yang
disebabkan oleh Salmonella typhi.
Selain itu, dalam usus besar manusia, berfungsi untuk menekan pertumbuhan
bakteri jahat dan membantu memproduksi vitamin K melalui proses pembusukan.
Sedangkan peran dari bakteri Bacillus
substillis adalah sebagai penghasil antibiotic untuk pengobatan infeksi
bakteri gram positif.
I.
Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang dilakukan, maka dapat
disimpulkan bahwa:
- Untuk
identifikasi morfologi mikroorganisme (khususnya bakteri) dapat dilakukan
dengan pewarnaan, baik pewarnaan gram positif maupun negatif.
- Pewarnaan
gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram positif dan bakteri gram
negatif dengan zat warna yang digunakan adalah zat warna primer, yaitu violet
dan zat warna sekunder, yaitu safranin
- Bakteri
Eschericia coli merupakan bakteri
gram negatif, karena pada pewarnaan menghasilkan warna merah, sedangkan bakteri
Bacillus substillis menghasilkan
warna merah sehingga merupakam bakteri positif.
- Bentuk
bakteri Eschericia coli dan Bacillus substillis adalah berbentuk
batang, dimana Eschericia coli ada
yang berbentuk batang rantai memanjang.
Alcamo,
I.E. 1996. Fundamentl of Microbiology, 5th
Edition. Addison Wesly Longman, Inc: New York.
Anggita.
2012. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. UIN
SGD: Bandung.
Dwijoseputro.
1981. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan:
Surabaya.
Kawuri,
R,Y Ramona, dkk. 2007. Buku Ajar
Mikrobiologi Farmasi. UNUD: Bukit Jimbaran
Pelczar Jr, dkk.
1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press:
Jakarta
SEMOGA BERMANFAAT!
Komentar
Posting Komentar